En una de las líneas de investigación del equipo de Bacteriología del IVIA, y enmarcado dentro del proyecto LIFE Vida For Citrus en el que participan, se está llevando a cabo el diseño y desarrollo de una nueva herramienta de detección molecular, basada en la amplificación isotérmica de ADN mediante el uso de enzimas de recombinación y polimerización, con el objetivo de que pueda llegar a ser un kit de diagnóstico rápido in situ de las tres bacterias asociadas al Huanglongbing.

Félix Morán y Ester Marco-Noales. Centro de Protección Vegetal y Biotecnología, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA), Moncada, Valencia, España.

La citricultura española goza, desde el punto de vista fitosanitario, de un excelente estado de salud. Esto se debe, en gran medida, a los programas de saneamiento, cuarentena y certificación de plantas de cítricos. Sin embargo, en los últimos años, a consecuencia de varios factores, como la globalización y el cambio climático, diversas enfermedades emergentes suponen una seria amenaza para el sector citrícola. La más grave es, sin duda, la enfermedad del HLB (Huan­g-lon­gbing, palabra de origen chi­no que significa enfermedad del brote amarillo), que se asocia a tres especies bacterianas de Can­didatus Liberibacter: Ca. L. asiaticus (CaLas), Ca. L. americanus (CaLam) y Ca L. africanus (CaLaf). Estas bacterias son transmitidas mediante dos especies de in­sectos vectores: los psílidos Diaphorina citri Kuwayama, que en condiciones de campo transmite CaLas y CaLam, y Trioza erytreae Del Guercio, que transmite CaLaf.

Foto 1. Síntomas asociados a la enfermedad del Huanglongbing (HLB) en Citrus x sinensis cv. Valencia: A) amarilleamiento de brotes que, con el tiempo, se va extendiendo por toda la rama; B) hojas con moteado clorótico y difuso; C) fruto de menor tamaño que el normal, con deformación y desviación de la columela central.

El HLB, extendido por muchos países de Asia, África y América, ha provocado la destrucción de millones de plantas de cítricos. Un ejemplo muy ilustrativo es el de Florida, donde se estima que, desde la de­tección del HLB en 2005, la producción de cítricos se ha reducido casi a la mitad. En la cuenca mediterránea no se ha de­tectado esta enfermedad, por lo que prevenir su entrada debe ser una prioridad no solo para el sector citrícola sino para la sociedad en general.

La enfermedad del HLB puede afectar a todas las especies y variedades de cítricos conocidas, incluyendo rutáceas ornamentales. La sintomatología consiste en un moteado clorótico y difuso en las hojas de los brotes, que se va extendiendo por toda la rama con el paso del tiempo, y da apariencia amarilla a esa parte del árbol (de ahí el nombre de la enfermedad), pu­diendo afectar en ocasiones al árbol entero (fotos 1a y 1b). Los frutos presentan un menor tamaño, deformaciones, maduración irregular, desviación de la columela central (foto 1c) y, en algunos casos, hay una inversión de la coloración durante el proceso de maduración.

Aunque España está actualmente libre de HLB, uno de los vectores se encuentra ya muy próximo a algunas de las principales zonas citrícolas del país. Se trata de la psila africana, T. erytreae, que fue detectada en el noroeste peninsular en 2014, y desde entonces se ha ido extendiendo por Portugal hasta alcanzar la zona del Al­garve. Por otra parte, la psila asiática D. citri ha sido recientemente detectada en la cuenca mediterránea, en el valle de Hefer en Israel. La rápida dispersión de los vectores y su capacidad de adaptación a nuevos ecosistemas incrementan el riesgo de aparición de la enfermedad en nuestros cítricos.

Es fundamental que nos anticipemos a la llegada de los vectores, y optimicemos las estrategias para evitar la introducción y dispersión de la enfermedad. Y para que las estrategias de prevención y control sean realmente efectivas es necesario disponer de herramientas de diagnóstico fiables, específicas, precisas y sensibles, las cuales permitan adoptar medidas correctivas rápidas y eficaces ante una posible detección. Actualmente, la PCR en tiempo real, dada su buena sensibilidad, es la técnica estrella para el diagnóstico de numerosas enfermedades de plantas, incluido el HLB. Pero para un primer diagnóstico rápido in situ hay que buscar técnicas alternativas que requieran un menor tiempo de procesado de la muestra y un equipamiento sencillo.

Diseño del kit de detección

Para el diseño del kit de detección de HLB, se es­tu­diaron genomas completos de las especies CaLas, CaLam y CaLaf, de distintos orígenes geográficos, con el objetivo de buscar una región intraespecífica conservada que permitiese la detección de las tres especies bacterianas simultáneamente. Los genomas se compararon mediante un programa informático, y la selección de la región genómica más idónea para el di­seño del kit se basó en los porcentajes de identidad que existían entre los diferentes genomas. Así, se consiguió localizar una región altamente conservada entre todos los genomas comparados que pertenece a un gen de mantenimiento celular.

Material empleado para la puesta a punto del kit
Para la puesta a punto de la técnica se necesitaban muestras tanto positivas (in­fectadas de HLB) como negativas (sanas). Las muestras infectadas consistieron en: material vegetal de Citrus x sinensis cv. Valencia, Citrus × hystrix, Ci­trus × reshni y Rusk citrange, originarias de Brasil (Estados de São Paulo y Pa­raná), Costa Rica (San José) y Cuba; y es­pecímenes de D. citri de Cuba y Estados Unidos (Florida). Las muestras sanas empleadas como controles negativos consistieron en: material vegetal de las especies Citrus x sinensis cv. Lane Late, Citrus x clementina cv. Clemenules y Citrus x li­mon cv. Fino Mesero, originarias de Es­pa­ña (Valencia); y especímenes de T. erytreae procedentes de Sudáfrica y del norte de España.

Figura 1. Sensibilidad técnica del kit RPA-HLB universal evaluada con ADN sintético de Ca. Liberibacter asiaticus diluido en material vegetal sano de Citrus x sinensis cv. Lane. Las curvas de amplificación se observan a partir de 43 copias del ADN por microlitro de reacción.

Adicionalmente se incluyeron en la puesta a punto del método algunas muestras vegetales y de insectos que, de acuerdo a publicaciones previas de nuestro equipo, ocasionan falsos positivos si se emplean los protocolos de PCR en tiempo real recomendados por la European Plant Protection Organization (EPPO).

Desarrollo y validación del kit
El segundo paso fue evaluar la sensibilidad técnica del prototipo de kit RPA-HLB universal, para lo cual se utilizaron tres fragmentos de ADN sintético que contenían la secuencia específica de la diana molecular del kit; los fragmentos se diluyeron en extractos de Citrus x sinensis cv. Lane no infectados y después se cuantificaron.

Los resultados mostraron que, por un lado, el kit es capaz de detectar se­cuencias sintéticas de las tres especies aso­ciadas al HLB (CaLas, CaLam y CaLaf) y, por otro lado, que su límite de detección, en las condiciones analizadas, osciló entre las 4 y las 8 copias por microlitro de volumen de extracto, es decir, una muy buena sensibilidad. En la figura 1 se muestra una gráfica de las amplificaciones obtenidas a partir de las diluciones del ADN sintético co­rrespondiente a CaLas.

La excelente sensibilidad técnica obtenida se debía, en gran parte, a que el ADN sintético empleado se encontraba diluido en material vegetal sano y no envuelto en pa­redes vegetales o membranas celulares, lo cual lo hace más accesible a las enzimas implicadas en la amplificación. Por ello era necesario realizar un ensayo con material naturalmente infectado. Por tanto, en el tercer paso, el material vegetal de cada una de las muestras a analizar se trituró en un tampón de extracción, mientras que cada espécimen de insecto fue aplastado sobre una membrana de papel que, posteriormente, se resuspendió en tampón. Alícuotas de 1 µl de cada homogeneizado o extracto crudo obtenido se em­plearon para la detección directa me­diante el kit RPA-HLB universal.

Para la validación del kit se siguieron los parámetros recomendados por la EPPO, que incluyen:

• Sensibilidad analítica (cantidad mínima que la técnica puede detectar de ma­nera fiable).
• Especificidad analítica, que engloba inclusividad (detección de varian­tes/­ais­­lados representativos de la diversidad genética y geográfica de la bacteria diana) y exclusividad del método (la no detección de otras bacterias que po­drían estar presentes en el mismo há­bitat).
• Selectividad (evaluación del rendimiento de la prueba utilizando diferentes cultivares de cítricos).

Foto 2. Análisis in situ de la presencia de HLB: A) examen visual de una planta de cítricos; B) extracción manual de los peciolos de las hojas de cítricos; C) amplificación obtenida en tiempo real con el kit de diagnóstico rápido RPA-HLB universal.

Los resultados mostraron que con el kit de diagnóstico desarrollado se pueden lle­gar a detectar hasta 70 copias/µl en ma­terial vegetal naturalmente infectado, y has­­ta 30 copias/µl en insecto (cuadro I). Es­tos resultados coincidían con los obtenidos en el análisis de cuantificación por PCR de los controles positivos empleados en este estudio, donde con el kit se detectaron aquellas muestras con títulos bacterianos iguales o superiores a 10 copias/µl. Por tanto, se puede decir que la sensibilidad analítica del kit RPA-HLB universal está en torno a 10 bacterias/µl, tanto en material vegetal como de insecto.

Respecto a la inclusividad del kit, evaluada mediante el análisis de plantas e insectos vectores infectados de HLB procedentes de diferentes orígenes geográficos, el kit pudo detectar Ca. Liberibacter en muestras de Citrus x sinensis cv. Va­len­cia, Citrus × hystrix, Citrus × reshni y Rusk citrange procedentes de Brasil, Costa Rica y Cuba. Y también en insectos vectores de D. citri procedentes de Es­ta­dos Unidos y Cuba. Estos resultados su­gieren que con el nuevo kit desarrollado se pueden detectar diferentes aislados bacterianos asociados al HLB procedentes de orígenes en donde está establecida la enfermedad, independientemente del tipo de muestra (vegetal o insecto) a analizar.

Cuadro I.

En cuanto a los resultados de exclusividad, evaluada mediante el análisis de muestras de cítricos y de insectos vectores libres de HLB, no se obtuvo ningún resultado positivo con el kit, ni siquiera en muestras problemáticas que daban falsos positivos con otras técnicas. Esto sugiere que el nuevo método, además de permitir detectar las tres especies de Ca. Li­be­ri­bac­ter asociadas al HLB, permite excluir a la microbiota más común que comparte nicho con estas bacterias patógenas, ha­ciendo del kit un método fiable y preciso en el que la aparición de falsos positivos es muy improbable.

La selectividad del método se abordó analizando aislados que infectaban diferentes cultivares y especies de cítricos, y se comprobó que este factor no afectó al resultado final. Por tanto, el kit puede utilizarse a priori con cualquier especie y va­riedad de cítrico.

Prueba de campo

Cuadro II.

Para la evaluación en campo del kit de diagnóstico se realizaron dos prospecciones aleatorias en áreas de São Paulo (Brasil) y San José (Costa Rica), recolectando muestras de Citrus x sinensis cv. Valencia con diferente grado de incidencia de HLB, y tanto con síntomas como sin síntomas. Las muestras se analizaron con el kit de diagnóstico rápido desarrollado en este estudio y, paralelamente, mediante PCR en tiempo real de acuerdo a un protocolo ya establecido.

La comparación reveló que la sensibilidad diagnóstica del nuevo kit RPA-HLB uni­versal alcanzó niveles de 72,73%, la precisión relativa fue del 85,12% y la especificidad diagnóstica del 100% (cuadro II). Estos valores, tratándose de una técnica que no utiliza ADN purificado, a diferencia de la PCR, son muy elevados. El coste de procesado de la muestra, por tanto, se re­duce, y, además, los resultados se ob­tie­nen en unos 35 minutos. Todo ello hace que el kit se postule como una herramienta muy adecuada para un diagnóstico rápido que puede realizarse in situ (foto 2).