Con el objetivo de desarrollar un método diagnóstico simple y eficiente, dentro del “Estudio transcriptómico dirigido al desarrollo de un kit diagnóstico para detección precoz de las principales enfermedades en olivar causadas por patógenos del suelo”, se ha analizado la respuesta del árbol a diferentes situaciones de estrés biótico y abiótico, mediante potentes técnicas de genómica funcional. Esto ha permitido identificar decenas de miles de genes del olivo e determinar entre todos ellos la existencia de genes que el árbol expresa solamente en presencia de V. dahliae, y que son la base del desarrollo de un kit de diagnóstico.

María de la O Leyva¹, Jaime Jiménez¹, Juan Bautista Barroso¹, Jesús Mercado² y Francisco Luque¹.
1 Centro de Estudios Avanzados en Olivar y Aceite de Oliva de la Universidad de Jaén
2 Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba

El estado fitosanitario del olivar andaluz se enfrenta al reto del significativo avance que la verticilosis está teniendo en los últimos años. La pérdida de árboles por enfermedades producidas por patógenos del suelo, como la causada por el hongo Verticillium dahliae, o la denominada “seca” producida por especies del género oomiceto Phytophthora u otros patógenos, supone un coste importante para muchas explotaciones.

Los métodos de diagnóstico molecular desarrollados hasta el momento y basados en la detección del ADN del patógeno en tejidos infectados de la planta, si bien son efectivos y muy específicos, no permiten una evaluación lo suficientemente sencilla, económica e inmediata como para que el agricultor pueda en la práctica saber cuál es la causa de la enfermedad de sus olivos.

Especialmente importante es determinar si el árbol se encuentra infectado por V. dahliae, ya que el micelio de este hongo una vez que penetra en los haces vasculares de la raíz de plantas puede alcanzar prácticamente todos los órganos de la misma.

En los estadios finales de la enfermedad pueden producirse en órganos senescentes o moribundos formas de resistencia conocidas como microesclerocios que, al ser liberadas a partir de hojas (marchitas o no) caídas o de otros restos vegetales infectados en el suelo, donde pueden persistir durante décadas, constituyen la fuente de inóculo principal del patógeno. Esto hace que los árboles infectados por V. dahliae se conviertan en focos de propagación de la enfermedad. Por este motivo, el diagnóstico preciso de la verticilosis es esencial para la toma adecuada de decisiones que ayuden a un control efectivo.

Con el objetivo de desarrollar un método diagnóstico simple y eficiente iniciamos hace ahora cuatro años un proyecto de investigación financiado por la Junta de Andalucía titulado “Estudio transcriptómico dirigido al desarrollo de un kit diagnóstico para detección precoz de las principales enfermedades en olivar causadas por patógenos del suelo”, proyecto de Excelencia AGR-5948.

En este proyecto hemos estudiado la respuesta del árbol a diferentes situaciones de estrés biótico y abiótico, mediante potentes técnicas de genómica funcional. Esto nos ha permitido identificar decenas de miles de genes del olivo e determinar entre todos ellos la existencia de genes que el árbol expresa solamente en presencia de V. dahliae. Concretamente, un gen que se identifica por el código “contig_172143” resultó ser altamente específico de la infección por V. dahliae (cuadro I), por lo que la detección de sus productos se puede utilizar para comprobar si la planta está infectada por este patógeno en particular.

Cuadro I. La expresión del Contig_172143 se produce específicamente en respuesta a la infección por V. dahliae.

Datos de expresión en hojas. Los valores están expresados en el parámetro RPKM que indica el nivel de expresión del gen medido por RNAseq.

Además de su especificidad, es muy interesante destacar que tan solo quince días después de inocular la planta con un aislado de V. dahliae del patotipo defoliante (el más virulento de los que infectan olivo) ya es posible detectar los productos de este gen, y que la expresión del mismo se produce de forma más evidente en tejidos en los que los síntomas de la enfermedad aún no son visibles (figura 1).

Figura 1. La expresión del Contig_172143 se produce en las hojas entre los 7 y 15 días de la infección, medido por Q-RT-PCR.

El uso de los productos de este gen como base para el diagnóstico de la verticilosis del olivo está protegido por la patente P201331633, de fecha de solicitud 8 de noviembre 2013. Esta patente es propiedad de la Universidad de Jaén y del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y los derechos de explotación han sido licenciados recientemente por la empresa Nutesca.

Es interesante destacar que este gen es igualmente válido para diagnosticar la infección de árboles tanto de cultivares considerados como susceptibles a la verticilosis, caso de la variedad Picual, como de aquellos catalogados como tolerantes o resistentes, como ocurre con la variedad Frantoio. En este sentido es importante tener en cuenta que no se han identificado hasta la fecha cultivares verdaderamente resistentes a la infección por V. dahliae.

Figura 2. El Contig_172143 responde a la infección por V. dahliae tanto en la variedad Picual (susceptible) como en Frantoio (resistente). Pic= Picual; Fr= Frantoio; ctrl= control; H= heridas en las raíces; inf= infectado por V. dahliae; 15d= 15 días desde la infección, inoculación o la herida.

Efectivamente, los cultivares tolerantes también pueden ser colonizados por el hongo. La diferencia entre susceptibles y tolerantes estriba en que en los segundos la infección no llega a producir síntomas, o éstos son mucho menos severos que en los primeros. Sin embargo, es factible detectar la presencia del hongo en los tejidos del árbol, bien mediante aislamiento del mismo, bien detectando su ADN.

Por tanto, estos árboles también pueden constituir una fuente potencial de propágulos infectivos que continúan infestando el suelo y contribuyen a la expansión de la enfermedad. En la figura 2 se presenta la detección inequívoca de la expresión del contig_172143 en hojas de plantas infectadas por V. dahliae (patotipo defoliante) tanto del cultivar Picual como de Frantoio.

Desarrollo de un sistema de diagnóstico

Basado en este gen se está desarrollando un sistema de diagnóstico mediante la detección inmunológica de la proteína codificada por el mismo. Este sistema es similar a los empleados en diagnóstico de enfermedades en humanos o en los tests de embarazo.

Figura 3. Se muestran análisis Elisa por triplicado. 1,2 y 3 árboles enfermos pero libres de verticilosis; 4 y 5 árboles enfermos de verticilosis y 6 árbol sano.

Los resultados obtenidos hasta ahora son muy interesantes ya que es posible diferenciar perfectamente entre árboles afectados de verticilosis en situación de campo de otros que, teniendo síntomas similares, conocemos que están libres de V. dahliae ya que han sido diagnosticados previamente mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (figura 3).

El test diagnóstico se presentará en dos formatos diferentes. Por un lado se va a utilizar un sistema de kit Elisa dirigido a los laboratorios de Sanidad Vegetal, que producirá resultados similares a los de la figura 4. Por otro lado, se va a comercializar un kit basado en el uso de tiras inmunoreactivas que permitirá el diagnóstico directo por parte del propio agricultor (figura 4).

Resumiendo

Figura 4: Esquema del funcionamiento del kit de tiras. Los pasos son: 1) toma de hojas; 2) macerado de hojas; 3) mojado de la tira reactiva en el macerado; 4) lectura de las tiras tras unos minutos.

Como resultado del estudio realizado se ha identificado y secuenciado un gen de olivo que se puede utilizar para diagnosticar si una planta está o no infectada por V. dahliae, incluso en ausencia de síntomas.

Además, se han desarrollado las herramientas necesarias para que en breve se comercialicen dos kits diagnósticos de la verticilosis, uno con formato de test Elisa destinado a laboratorios y otro, particularmente dirigido al agricultor y/o viverista, con formato de tiras inmunoreactivas que permitirá un diagnóstico rápido, fácil y específico de la presencia de V. dahliae en muestras de tejidos del árbol. n